Wie man den richtigen Antikörper für einen erfolgreichen Test auswählt

Liebe Leserinnen und Leser,

Antikörper sind ein unverzichtbares Werkzeug für den Nachweis in biochemischen, zellbiologischen und immunologischen Laboren. Angesichts der Vielzahl an Antikörpern und Antikörperfragmenten, die für unterschiedlichste Anwendungen eingesetzt werden, und der zahlreichen Probleme, die antikörperabhängige Experimente gefährden können, ist es mitunter schwierig, den richtigen Antikörper zu finden. Häufige Ursachen für inkonsistente Ergebnisse sind Kreuzreaktionen, Chargenvariabilität und die Verwendung von Antikörpern in ungetesteten Anwendungen. Hier geben wir Ihnen einige praktische Tipps zur Auswahl des für Ihre Forschungszwecke optimalen Antikörpers.

Definieren Sie Ihr Zielprotein: Machen Sie sich mit der Biologie Ihres Zielproteins vertraut, da dieses sehr komplex sein kann und Sequenzidentität oder Homologie mit verwandten Proteinen zu Kreuzreaktionen führen kann. Nutzen Sie Datenbanken wie GeneCards, um die Nomenklatur und alternative Bezeichnungen des Antigens zu ermitteln, und UniProt, um die Aminosäuresequenz Ihres Zielproteins zu erhalten.

Wählen Sie die passende Anwendung: Wählen Sie die Anwendung, die am besten zu Ihrer Forschung passt. Dies hängt von der Art der Daten ab, die Sie zur Beantwortung Ihrer Forschungsfrage benötigen. Beispielsweise ist Western Blot eine bekannte Methode zur Untersuchung der Proteinkonzentration; Immunhistochemie und Immunzytochemie werden zur Untersuchung der Lokalisation eingesetzt, da sie mit fixierten Zellen und Geweben arbeiten; ELISA, FACS und Durchflusszytometrie hingegen sind geeignete Techniken zur Untersuchung von Proteininteraktionen und -expression.

Stellen Sie sicher, dass der Antikörper zu Ihrer Probe passt – Da sich Zielproteine in Sequenz und Struktur von Spezies zu Spezies unterscheiden, verwenden Sie Antikörper, die speziell für Ihre Zielspezies validiert wurden. Vertrauen Sie in diesem Fall dem Datenblatt: Die Validierung eines Antikörpers für eine Spezies garantiert nicht dessen Funktion in anderen.

Wählen Sie einen kompatiblen Antikörper – Gehen Sie nicht davon aus, dass ein Antikörper, der in einer Anwendung ein Zielprotein detektiert, dies auch in anderen Anwendungen tut. Immunchemische Anwendungen basieren auf der Verwendung sensitiver und hochspezifischer Antikörper. Genauer gesagt, sie hängen von der Fähigkeit eines Antigens ab, das Zielprotein zu erkennen. Für eine effiziente Antigen-Antikörper-Interaktion muss das Epitop für die Bindung leicht zugänglich sein. Manchmal benötigt das Antigen das Zielprotein in seiner nativen und gefalteten Form oder in seiner denaturierten Form.

Durch Fixierung, pH-Wert-Änderungen oder während der Gelelektrophorese-Vorbereitung kann das Epitop verändert werden, was seine Interaktionsfähigkeit mit einem Antikörper beeinträchtigen kann. Beispielsweise kann ein Antikörper in einer IHC-Studie ein Epitop in einem gefrorenen Gewebeschnitt erkennen, aber dieses Epitop ist möglicherweise in einer Probe, die für eine Western-Blot-Analyse denaturiert wurde, nicht zugänglich.

Wählen Sie Ihre Wirtsspezies – Im Allgemeinen wird empfohlen, Wirtsantikörper zu vermeiden, die mit der Spezies Ihrer Zielproben identisch sind, um Interferenzen mit Immunglobulinen auszuschließen. Berücksichtigen Sie bei der Wahl der Wirtsspezies die gegen die Wirtsspezies des primären Antikörpers gerichteten Sekundärantikörper, die entsprechend der Anwendung ausgewählt wurden.

Studieren Sie das Produktdatenblatt und bereiten Sie sich auf die Protokolloptimierung vor – Produktdatenblätter enthalten in der Regel viele wichtige Details, darunter die Beschreibung des Immunogens, die Art des Epitops, die Wirtsspezies, die Kreuzreaktivität und empfohlene Startverdünnungen. Daher sind bei der Protokollerstellung viele Faktoren zu berücksichtigen, wie z. B. der Blockierungspuffer, die Antikörperverdünnungsmittel, die Dauer der Inkubationsschritte und die Nachweismethode. All diese zusätzlichen Details helfen Ihnen, Ihr Protokoll für einen erfolgreichen Assay zu optimieren.

Führen Sie immer Kontrollen durch – Bei der Planung eines Experiments sind Kontrollen entscheidend, um zu verstehen, ob das Ergebnis erfolgreich war oder nicht. Die meisten gängigen experimentellen Techniken erfordern spezifische Kontrollen, um die Dateninterpretation zu erleichtern. Beispielsweise sollten Western Blots immer eine Ladekontrolle enthalten, während IHC und IF immer mehr als eine Negativkontrolle haben sollten, um das Signal vom Hintergrundrauschen zu unterscheiden.

Beispiele für Positivkontrollen sind rekombinante Proteine oder Lysate von Zelllinien, die bekanntermaßen nachweisbare Zielproteinmengen produzieren. Negativkontrollen könnten Knockout-Proben oder das Weglassen des primären Antikörpers umfassen. Beide Methoden ermöglichen die Erkennung von Hintergrundfärbungen durch den sekundären Antikörper.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Suche nach einem geeigneten Antikörper für eine spezifische Anwendung zwar mitunter schwierig sein kann, wir jedoch hoffen, dass diese Tipps und Richtlinien Ihnen hilfreiche Anhaltspunkte für Ihre Suche bieten. Wenn Sie diese oder andere Möglichkeiten zur Prüfung von Antikörpern vor dem Kauf besprechen möchten, kontaktieren Sie uns unter info@bma.ch. Wir helfen Ihnen gerne weiter!